酵素反応の定量的解析キット

キットの使い方

I．溶液の調製

1. 各チューブの蓋に付着している粉や溶液を遠心などの操作により落とす。
2. 1.5 mL チューブの乳酸脱水素酵素 LDH (350 μM) を全量 (20 μL) とり、50 mL チューブのLDH 希釈溶液 (20 mL) に加え、優しく混合し、350 nM 乳酸脱水素酵素溶液とする。
3. 50 mL チューブのピルビン酸ナトリウム (10 mM) について、付属の 1.5 mL チューブを使用し、純水で希釈することで 0.4、1、2、4、10 mM ピルビン酸ナトリウム溶液を作製する。
4. 50 mL チューブの NADH の粉に、NADH 溶解液* (30 mL) 全量を加えて溶かし、3 mM NADH 溶液とする。

　　　＊弱アルカリ性の溶液である。NADHは弱アルカリで安定であるが酸性では不安定であり
　　　　（NAD⁺はその逆）、溶液の長期保存はできない。

II. 乳酸脱水素酵素 LDH による反応の初速度の測定

1. 分光光度計を立ち上げ、340 nm の吸光度の時間変化測定が行える状態にする。
2. 次の 4 つの溶液を恒温槽に立てて 25℃ にしておく。次に以下に示す液量をセルに入れる。

　　　500 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 7.0)　        　　　 0.2 mL

　　　3 mM NADH    　　　　　　　　　　　             　　　 0.1 mL

　　　ピルビン酸ナトリウム (0.4, 1, 2, 4, または 10 mM)  　　 0.2 mL

　　　純水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.4 mL

3. セルを分光光度計のセルホルダーに入れ、セル内の溶液が 25℃ になるのを待つ。その間に、酵素を入れない時の 340 nm の吸光度の時間変化を記録する。
4. セルを取り出し、350 nM 乳酸脱水素酵素溶液 0.1 mL をセルに加える。パラフィルムでセルの口を押えて速やかに 4～5 回反転してよく混合する。時間をおかずに直ちに分光器のセルホルダーに挿入し、340 nm の吸光度の時間変化を記録する。
5. 同じ操作を複数のピルビン酸濃度で行う。
6. 酵素反応の阻害実験を行う場合は、引き続き、オキサミン酸を加えた条件で、同様の操作を行う。

　　　500 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 7.0)        　　　  　 0.2 mL

　　　3 mM NADH    　　　　　　　　　　　              　　　 0.1 mL

　　　ピルビン酸ナトリウム (0.4, 1, 2, 4, または 10 mM)　  　 0.2 mL

　　　1 mM オキサミン酸ナトリウム溶液　　　　　　　　　 0.2 mL

　　　純水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.2 mL

III. データ解析

1. 各々の反応プロファイル (吸光度の時間変化) において、反応開始後に直線的に吸光度が変化している領域について直線を引き、その傾きを求める。例えば、1分間に、340 nm の吸光度（A₃₄₀）が 0.01 変化する場合には、1秒間あたりの吸光度変化は ΔA₃₄₀ = 0.01/60 。
2. 1 cm のセルを用いた場合、酵素反応によって 1 M の NADH が NAD⁺ に変化した時には 340 nm の吸光度が 6,220 変化することが分かっている。これにより、上記１で求めた傾き (1 秒間あたりの吸光度変化) を 1 秒間あたりの NADH の減少量に換算する。これが反応速度 v である。
3. 縦軸に v、横軸にピルビン酸濃度をとってグラフを描く。
4. 回帰分析が行える場合には、想定した反応スキームから導いた v　を表す式 (標準的なミカエリスメンテン式の場合は v = V_max[S]/([S] + K_m) をフィッティングすることで、反応速度論的パラメータを求める。回帰分析が行えない場合、縦軸に 1/v、横軸に 1/ピルビン酸濃度をプロットする。標準的なミカエリスメンテン式の場合、このプロットは直線となり、縦軸との交点が 1/ V_max、傾きが V_max / K_m を表す。これを利用して V_max と K_m を求める。
5. V_max = k_cat [E]₀ より、k_cat を計算して、1秒間に酵素が何回働くかを計算する。

以下のようなグラフを作ることができます。

( 1 )
基質（ピルビン酸）の濃度を変えて LDH の反応速度を測定した。
ピルビン酸濃度が高くなるにつれ、反応速度が大きくなることが分かる。
反応開始直後からの傾きが一定である領域から、各条件での反応速度（初速度）を求めた。